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          細胞表面抗原染色

          發布時間: 2020-09-22   

          細胞表面分子流式檢測步驟說明注意事項

          1. 在使用抗體之前,快速甩動一下,使之聚集到管的底部;

          2. 熒光標記的抗體應該避光保存在4℃,不要冷凍;

          3. 當染色的時候,固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號。為了得到更好的結果,染色后應該馬上分析。

          過程概述:

          1. 制作外周血、淋巴組織或者培養細胞的單細胞懸液;

          2. 細胞染色抗體(包括直接標記抗體和間接標記抗體);

          3. 洗滌步驟棄掉所有的為束縛的試劑

          4. 運行分析流式儀。

          注意:流式細胞染色實驗中,所有實驗條件的優化都很重要。關鍵參數包括靶細胞、抗體效價以及動力學。

          試驗A:小鼠淋巴細胞懸液的免疫熒光染色

          材料:12×75 mm的圓底試管(Falcon Cat.No.2008)或96孔圓底微量滴定板(Falcon Cat.No.3910),原始抗體(既未純化也未偶聯),

          緩沖液: eBioscience流式染色緩沖液(Cat.No.00-4222),流式鞘液

          儀器:移液管和移液器,離心機,冰柜或冰箱,流式儀

          試驗時間

          半個小時細胞準備,半個小時抗體稀釋和樣品準備,半個小時到一個小時孵育過程,半個小時以上的運行和分析時間

          方法細胞準備:

          1. 采集組織(脾,淋巴結,胸腺),用注射器的活塞擠壓以制成單細胞懸液,此過程用10ml的染色緩沖液;

          2. 轉移到50ml的圓錐形試管中并使大塊沉淀到試管底部或者通過尼龍濾網過濾,得到單細胞懸液;

          3. 4℃ 離心沉淀細胞懸液4-5分鐘(300-400g),棄掉上清;

          4. 如果上過程采集的脾,還用用RBC裂解,否則進入下一步;

          5. 用50ml染色液重懸樣本,進行細胞計數和活力分析;

          6. 再次離心細胞,棄掉上清,重懸細胞使其細胞數達到2×107 個/ml;


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